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Wnt替代蛋白对ox-LDL致血管内皮细胞凋亡的拮抗作用
杨宏发 欧奇林 徐健强 曾高峰*通讯作者
南华大学附属第二医院心血管内科 湖南省 衡阳市 421000
【关键词】Wnt-替代蛋白，Wnt信号通路，氧化型低密度脂蛋白; 细胞凋亡; 动脉粥样硬化
【摘要】目的 研究Wnt替代蛋白（Wnt-S）对氧化型低密度脂蛋白( ox-LDL) 诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 凋亡的影响及其可能机制。方法 在HEK293F细胞中瞬时转染pcDNA3.1(+)-Wnt-S质粒，表达纯化Wnt-S蛋白； Topflash，qPCR以及Western Blot实验确定最佳的Wnt-S激活Wnt信号通路浓度； MTT实验检测HUVEC存活率以及最佳的ox-LDL处理浓度；Hoechst染色检测细胞凋亡，Western Blot分析Cleaved Caspase-3蛋白的表达情况。结果 实验成功表达和纯化Wnt-S蛋白；Wnt-S蛋白的最佳激活浓度是100ng /mL；ox-LDL最佳处理浓度是60mg/L；Wnt-S蛋白提高HUVEC的存活率，可通过减少Cleaved Caspase-3而有效拮抗ox-LDL诱导的HUVEC凋亡。 结论 Wnt-S蛋白可通过激活Wnt细胞通路拮抗ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡。
The antagonistic effect of Wnt Surrogate on apoptosis of human umbilical vein endothelial
cells induced by oxidized low density lipoprotein
[KEY WORDS] Wnt-S; Wnt signal patheway; oxidized low density lipoprotein; cell apoptosis; atherosclerosis
[ABSTRACT] Aim To investigate the effect of Wnt surrogate protein (Wnt-S) on apoptosis induced by oxidized low density lipoprotein ( ox-LDL) and its possible mechanism． Methods PcDNA3.1(+)-Wnt-S plasmid was transfected into HEK293F cells to express and purify Wnt-S protein; Topflash, qPCR and Western Blot was performed to detect the best concentration of Wnt-S to activite Wnt signal pathway in HUVEC cells. MTT assay was used to detect the survival rate of HUVEC and the optimal concentration of ox-LDL. Hoechst staining was applied to detect apoptosis. Western Blot was used to analyze the expression of Cleaved Caspase-3 protein. Results Wnt-S protein was successfully expressed and purified; the optimal activation concentration of Wnt-S protein was 100ng/mL; the optimal treatment concentration of ox-LDL was 60mg/L; Wnt-S protein increased the survival rate of HUVEC and effectively antagonized the apoptosis of HUVEC induced by ox-LDL by reducing Cleaved Caspase-3. Conclusion Similar to natural Wnt3a protein，Wnt-S proteins can antagonize ox-LDL-induced apoptosis of vascular endothelial cells by activating Wnt cell pathway.
动脉粥样硬化是现今最常见的心血管疾病之一，其患病率、发病率及死亡率在我国持续增长，给社会和家庭带来了沉重的负担[1]。动脉粥样硬化的发病机制与内皮细胞损伤密切相关，其早期病理特征为血管内皮细胞功能的紊乱，由此引发血管结构和形态发生明显改变。内皮细胞功能的损伤被认为是动脉粥样硬化的关键环节，而其凋亡贯穿动脉粥样硬化始末[2]。氧化型低密度脂蛋白( oxidized low density lipoprotein，ox-LDL) 是动脉粥样硬化中诱导内皮细胞凋亡的最常见因素之一，被认为是动脉粥样硬化发生发展的独立危险因素[3]。
Wnt是一类分泌性糖蛋白，通过与其受体FZD和LRP5/6结合，诱导依赖于β-catenin的信号通路激活，进而调节多个生物过程[4]。有研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在血管发育，特别是维持内皮细胞稳态上起着关键作用[5]。天然的Wnt蛋白由于侧链存在棕榈油酸酯修饰，水溶性差，难以表达纯化，极大地限制其生物和医学应用[6]。根据Wnt信号通路激活的特点，构造出一种新型Wnt替代蛋白(Wnt surrogate，Wnt-S)，由FZD受体的中和抗体Vantictumab的单链可变区( scFv，single-chain variable fragment ) 和LRP5/6 结合蛋白DKK1的C端区域通过一个铰链区连接而成，形成一个新的融合蛋白scFv-DKK1c（图1）。这种人工合成的Wnt-S蛋白能模拟天然的Wnt蛋白，激活下游的Wnt /β-catenin 信号通路，且易溶于水、容易表达纯化，在细胞和动物实验都显示出很好的生物功能[7, 8]。
本研究拟以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)为研究对象，以ox-LDL诱导内皮细胞功能紊乱为模型，探讨Wnt-S蛋白能否通过激活Wnt /β-catenin 信号通路对ox-LDL诱导的HUVEC凋亡的影响及其可能的分子机制，为Wnt-S蛋白治疗动脉粥样硬化的临床应用提供理论依据和实验基础。
1.材料和方法
1.1 主要材料
pcDNA3.1(+)-Wnt-S，Luciferase和Rellina质粒来自斯坦福大学。PEI( Polysciences) ，Ni SepharoseTM 6 Fast Flow( GE Healthcare) ，BCA 蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher) ，ECL 发光液(Millipore)， Dual-Luciferase Reporter Assay System, His-Tag ( D3110) XP Rabbit mAb和Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody (中杉金桥)。DMEM 高糖培养基和双抗(HyCloneTM) ，澳洲胎牛血清，FreestyleTM 293 Expression Medium( Invitrogen) 。TRIzol Reagent( Life technologies) ，Direct-zol ＲNA Miniprep( ZYMO RESEARCH) ，反转录试剂盒和SYBR qPCR Mix( 诺唯赞) 。
1.2 HEK293F细胞转染
转染前对HEK293F 细胞行计数，用40 ml PBS 稀释质粒( 800 μg) ，混匀记为A液，用40 ml PBS 稀释PEI( 1600 μl) ，混匀记为B液( 质粒: PEI = 1:2，W/ V) ，室温静置5 min。将B液缓慢加入到A液中，用涡旋振荡器边加边振荡，室温静置15min。将DNA-PEI 混合液缓慢加入到720ml FreestyleTM 293 Expression 培养基中，轻轻混匀，使细胞密度在约1×106 cells /ml，置于37 ℃，5 % CO2，125 r /min 细胞培养箱的水平摇床中培养。每天取少量培养基，检测细胞活度，待细胞活度下降至70%左右时，停止培养，1000 r /min离心收集上清，置于冰箱待用。
1.3 Wnt-S 蛋白表达纯化
组装好恒流泵，在纯化柱中加入0.5ml Ni SepharoseTM 6 Fast Flow，开启恒流泵，用平衡液平衡纯化柱20min。将进液管插入含Wnt-S蛋白的上清底层，出液管插入Wnt-S蛋白的上清上方，液体匀速流过柱子， 4℃环境下，纯化48h。用20mmol /ml，咪唑洗涤柱子后，再用500mmol /ml洗脱柱子，收集洗脱液，然后用10kDa 离心过滤器进行超滤，4 ℃，8000r /min，15 min条件下离心，浓缩后的液体即为Wnt-S蛋白溶液。
Top-Flash实验
用于检测Wnt信号通路总体的激活情况。收集处理后的细胞，裂解液常温裂解15分钟后，取出裂解后的细胞悬液放入不透光的96孔板里。96孔板放入仪器，选取promega的双荧光素实验程序进行加样和读数(参照promega试剂盒说明书)。
1.5 实时荧光定量PCR
用于检测Wnt信号通路下游基因Axin2的表达。收集处理后的细胞，Trizol裂解，RNA提取试剂盒提取总RNA，Nano Drop测定RNA的浓度，逆转录得到cDNA，然后进行qPCR(参照Takara试剂盒说明书)。
1.6 Western blot 检测
蛋白BCA 蛋白定量试剂盒检测样品的浓度，计算上样量。取一定量蛋白与5x蛋白上样缓冲液混匀，置于100 ℃金属浴中处理5min，配制10%分离胶和5%浓缩胶，进行电泳。电泳条件: 80V，30 min，120 V至溴酚蓝进入浓缩胶底部。转膜条件:130mA，90~120min。5% BSA于TBST封闭2 h，一抗4 ℃过夜孵育。TBST洗膜3次，5min /次，孵二抗，常温1 h，TBST 洗膜3次，5min /次，显影。
1.7 HUVEC细胞培养及分组
HUVEC 生长于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养，细胞贴壁并长至70%～80%时，用0.05%胰蛋白酶消化传代。HUVEC生长至传代融合度后，分别用1ng /mL，3ng /mL，10 ng /mL，30 ng /mL，100 ng /mL Wnt-S蛋白刺激HUVEC 24 h，以确定最佳的Wnt-S蛋白激活Wnt信号通路浓度。分别用20 mg /L，40 mg /L，60 mg /L，80 mg /L以及100 mg /L 的ox-LDL 刺激HUVEC 24 h，以确定最佳ox-LDL处理浓度。Wnt-S蛋白抗凋亡实验实验分为空白对照组(Control) 、ox-LDL 组、ox-LDL+Wnt-S蛋白组。
1.8 ox-LDL 制备及鉴定
利用硫酸铜( CuSO4) 修饰低密度脂蛋白制备ox-LDL，采用硫代巴比妥酸法鉴定。
1.9 MTT法检测细胞存活率
HUVEC细胞以5×104/ml的密度接种于96孔板，每孔200μl。不同浓度的ox-LDL处理20小时后，每孔加入MTT( 5mg/ml) 20μl, 37℃ CO2孵箱继续孵育4小时。采用翻板法将96孔板中培养基弃去，并注意要吸净板底残留培养基，每孔中加入溶解液DMSO 150μl，37℃振荡15min使结晶充分溶解，在酶标仪上以波长570nm检测每孔的OD值，每组5个复孔，实验重复3次。
1.10 Hoechest 33342荧光染色法检测凋亡
HUVEC细胞以5×104/ml的密度接种于96孔板，除空白对照组外，，实验组处理24小时后，弃培养基，每孔加入4%多聚甲醛500μl，室温固定30分钟。PBS漂洗两遍后加入Hoechst 33342，使细胞中终浓度为10μg/ml，37度孵育30分钟后荧光显微镜下观察，最大激发波长361nm，最大发射波长460nm。正常细胞呈均匀的蓝色荧光，而凋亡细胞可见细胞核呈浓缩的半月形、分叶状或碎块状荧光。随机选取3个视野统计阳性细胞数，求平均值，每组2个复孔，重复5次，计算细胞凋亡发生率。
2 结果
2.1 Wnt-S 蛋白表达载体的鉴定以及Wnt-s蛋白的纯化和检测
核酸电泳鉴定的结果显示Wnt-S in pcDNA3.1(+) 质粒成功构建。 Wnt-S蛋白的细胞转染和表达Western blot 结果表明在转染后的细胞上清中检测到了Wnt-S蛋白，其表达纯化的最佳条件为转染后5d收集上清，50mmol /ml 咪唑洗涤柱子后，500 mmol /ml 咪唑洗脱( 见图2) 。
2.2 Wnt-S 蛋白对HUVEC细胞中Wnt /β-catenin 信号通路的激活作用
首先，TOP flash结果显示Wnt信号通路的活性随着Wnt-S蛋白浓度的增加而显著升高，且存在剂量依赖性。其次，实时荧光定量PCR的结果显示加Wnt-S 蛋白和Wnt3a 蛋白处理后，HUVEC细胞中Axin2 表达显著性上调，核内β-catenin蛋白明显增加，Wnt/β-catenin信号通路被显著激活(见图3) 。
2.3 Wnt-S蛋白可拮抗ox-LDL引起HUVEC细胞存活率的降低
将空白对照组细胞存活率设置为100%，选取20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L和100mg/L五个浓度的ox-LDL与HUVEC细胞共培养。MTT实验表明，与空白对照组相比，60mg /L的ox-LDL作用HUVEC 24 h 后，细胞存活率降低至36.5%，选择此浓度进行后续实验。Wnt-S处理能显著拮抗ox-LDL所致HUVEC细胞存活率的降低 (见图4) 。
2.4 Wnt-S的对凋亡的抑制作用
选取60 mg/L ox-LDL进行造模，100ng /mL Wnt-S蛋白做给药处理，ox-LDL组Hoechst 染色结果可见更多的细胞核呈亮蓝色荧光，细胞核具有凋亡形态特点，而ox-LDL+Wnt-S呈亮蓝色荧光细胞核明显减少。进一步的机制研究发现，与空白对照组相比，ox-LDL 组Cleaved Caspase-3表达显著上调( P ＜0. 01)；而用Wnt-S处理后，Cleaved Caspase-3表达水平较ox-LDL 组显著下调( P ＜0. 01)，表明ox-LDL 能促进HUVEC 中Caspase-3的活化，而Wnt-S蛋白可抑制ox-LDL 诱导的HUVEC中Caspase-3的激活(见图5)。
讨论
内皮功能障碍与凋亡是动脉粥样硬化发生发展的关键步骤，因此有效保护内皮细胞是改善动脉粥样硬化重要措施[9-11]。本研究以ox-LDL诱导HUVEC凋亡，在此基础上研究Wnt替代蛋白对ox-LDL诱导HUVEC凋亡的作用。结果显示，ox-LDL可显著降低HUVEC存活率，并诱导Caspase-3的活化和凋亡发生; 而经Wnt替代蛋白处理后细胞凋亡率显著降低，且Cleaved Caspase-3表达也显著降低。提示Wnt替代蛋白可拮抗ox- LDL诱导的HUVEC凋亡，具有一定保护血管内皮的活性。
目前已经发现了19种不同的哺乳类Wnt 蛋白，这些蛋白与10种FZD 受体杂乱的结合，形成了不同的生物学功能[12, 13]。Wnt 翻译后通过蛋白质棕榈化作用形成了棕榈油酸酯修饰，这个修饰对于Wnt 蛋白的分泌和其与FZD相互作用的关键位点形成至关重要[14]。然而，棕榈油酸酯化使天然Wnt 蛋白变得非常疏水，这严重阻碍了Wnt 重组蛋白的制备和应用[15]。本文中，我们发现人工合成的Wnt替代蛋白具有与天然Wnt3a 蛋白类似的生物学功能，都能激活HUVEC细胞中Wnt/β-catenin 信号通路。Wnt-S 蛋白的优势在于水溶性高、容易表达纯化和大规模制备，可能具有更广阔的生物和医学应用前景。
综上所述，本研究发现Wnt-S蛋白可通过激活Wnt细胞通路而减少Caspase-3活化，从而拮抗ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡，为Wnt-S蛋白在临床上应用于动脉粥样硬化的靶向治疗提供了理论依据。
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