荧光定量PCR在肺炎支原体感染早期诊断中的价值探索

发布日期：2022-03-07 16:26:26 浏览：459

荧光定量 PCR 在肺炎支原体感染早期诊断中的 价值探索

* 肖志刚. 肖宗浩. 刘海欧. 陈爱萍. 罗舜燕. 庄宇嫦 * （梅州市妇幼保健计划生育服务中心儿科，广东 梅州 514021） 

【摘要】目的：探讨荧光定量 PCR检测肺炎支原体（MP）-DNA早期诊断MP感染的价值。方法：选取 2018年 10月至 2019年 11月本院 187例确诊为肺炎疾病的患儿，分别采用荧光定量 PCR检测MP-DNA和酶联免疫吸附 法检测血清免疫球蛋白M（MP-IgM）。观察两种检查方法不同时间检测阳性率，两种方法及联合检测对不同年龄 段患儿的检测阳性率。结果：MP-DNA和联合检测入组时，MP感染阳性率高于MP-IgM检测，差异有统计学意 义（P＜0.05）；入组 1周、2周时，MP-DNA和联合检测MP感染阳性率高于MP-IgM检测，但差异均无统计学意义 （P＞0.05）。MP-DNA、MP-IgM及联合检测的年龄＜4岁、4~7岁、7~10岁和≥10岁患儿最终MP感染阳性率相 比差异均无统计学意义（P＞0.05）。进一步分析显示，联合检测高于MP-DNA检测的年龄主要在＜4岁和 4~7岁， 但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：荧光定量 PCR检测MP-DNA早期诊断MP感染的价值不低于MP-DNA 和MP-IgM联合检测。 

【关键词】肺炎支原体；脱氧核糖核酸；聚合酶链反应 

【中图分类号】R725.6. 【文献标识码】A. 【文章编号】2096-5249（2022）02-0001-04 

Study on correlation between vitamin D and iron deficiency  anemia in children

Chen Mei 1，Bian Ba Zhuo Ga  2 △ 

1.Department of Pediatrics，Tibet University School of Medicine，Lasa 850000，China 

2.department of Pediatrics，People's Hospital of Tibet Autonomous Region，Lasa 850000，China

【Abstract】Objective：To analyze the correlation between 25-hydroxyvitamin D and iron defificiency anemia  in children. Methods：From August 2019 to August 2021，children with iron defificiency anemia and children with  outpatient  health examination in  our  hospital were  selected as the  research  objects，including 127 children with  iron defificiency anemia as the research group，and 125 children with outpatient health examination as the control  group. General data and laboratory parameters [25-hydroxyvitamin D、serum ferritin（SF）、serum iron and hemoglobin（HGB）] were compared between the two groups. The children in the study group were divided into mild  iron defificiency anemia，moderate iron defificiency anemia and severe iron defificiency anemia according to their different levels of iron defificiency anemia，and the laboratory indicators of each group were compared. Pearson correlation analysis was used to test the correlation between iron defificiency anemia and 25-hydroxyvitamin D、SF， serum iron and HGB. Results：The levels of serum SF、serum iron、HGB and 25-hydroxyvitamin D in the study  group were lower than those in the control group and the difffference was statistically signifificant（P＜0.05 ）. Among 6 ·论著· 医学食疗与健康  2022 年 1 月第 20 卷第 2 期 the 127 patients，81 patients had mild iron defificiency anemia，35 patients had moderate iron defificiency anemia，and  11  patients  had  severe iron defificiency  anemia.  The levels  of  serum  SF，serum iron，HGB and 25-hydroxyvitamin D in  moderate  and  severe  groups  were lower than those in  mild  group  and the difffference  was  statistically  signifificant（P＜0.05 ），and the levels of serum SF，serum iron，HGB and 25-hydroxyvitamin D in severe group  were lower than those in moderate group and the difffference was statistically signifificant（P＜0.05）. Iron defificiency  anemia was positively correlated with serum SF，serum iron，HGB and 25-hydroxyvitamin D（P＜0.05）. Conclusion：25-hydroxyvitamin D is related to the occurrence of iron-defificiency anemia in children. The monitoring of  25-hydroxyvitamin D levels should be strengthened. Appropriate supplementation of vitamin D preparations may  alleviate the risk of anemia to a certain extent. 

【Key words】 Vitamin D; Iron defificiency anemia in children; The correlation

【Key Words】Mycoplasma pneumoniae; Deoxyribonucleic acid; Polymerase chain reaction 肺炎支原体（mycoplasma pneumaniae，MP）是急 性呼吸道感染、支气管炎、哮喘等的常见病原体，是儿 童社区获得性肺炎的重要病原体，MP肺炎占住院儿 童社区获得性肺炎的10％～40％[1]。MP感染除呼吸 道表现外，还可导致心肌炎、脑炎、肾炎等多种肺外并 发症及肺坏死，早期诊断、早期干预对预防重症及减 少并发症有重要作用。MP肺炎临床症状和特征与其 他肺部感染相似，临床易出现误诊，或仅仅依靠临床 症状体征难以与病毒、细菌、结核感染相互区别，需要 借助临床检验才能完成早期诊断。MP的常用病原学 检测方法包括MP培养和分离及MP血清学检测。MP 生长缓慢，一般培养法不能满足临床快速诊断需求， 血清学检测MP血清球蛋白M抗体（MP-IgM）受病程 的影响，具有一定的临床局限性。研究发现早期感 染患儿要在病程1周后才能检出IgM，而且患儿免疫 系统发育不完善，也会导致其抗体生产能力受限，提 高检测方案的假阴性率，影响临床疾病判断，降低治 疗效果。近年来分子检测技术广泛用于MP诊断，包 括普通聚合酶链反应（PCR）、反转录 -聚合酶链反应 （RT-PCR）等，可快速检测到体内微量MP-DNA，其 敏感性和特异性高，MP-DNA阳性率不受病程、是否 达到高峰及感染程度的影响，在发病初期对MP患儿 即具有诊断价值[2] 。本研究通过对187例肺炎患儿同 时采用MP-DNA和MP-IgM检测，进一步探讨MPDNA检测在小儿肺炎诊断中的应用价值，并尝试观察 MP-DNA和MP-IgM联合应用的诊断现将结果报告 如下。 1  对象与方法 1.1  研究对象 选 择 2018 年 10 月 至 2019 年 11 月在梅州市妇 幼保健计划生育服务中心儿科就诊的 187 例肺炎 患儿作为研究对象。187 例患儿中，男 99 例，女 88 例；年龄3个月~13.4岁（5.63±2.78）岁；病程4 h～7 d （2.13±1.09） d；体温（39.23±0.52）℃。 纳入标准：（1）年龄1个月～14岁，性别不限；（2） 符合《实用儿科学》[3] 中呼吸道感染的诊断标准，发病 至入院时间≤7 d，入院前未接受过抗生素治疗；（3）患 儿监护人对研究知情并签署知情同意书。 排除标准：（1）合并免疫缺陷、严重贫血、肺结核、恶性肿瘤、先天性支气管肺发育不良等疾病者；（2）精 神疾病、认知功能障碍患儿；（3）严重心、肝、肾等功能 不全者。 1.2  研究方法 患儿于入院当日、入院后1周、入院后2周采用无 菌咽拭子擦拭咽喉壁，利用荧光定量PCR检测拭取 物，采用ABI-7500荧光定量PCR仪检测，试剂盒购自 上海威正翔禹生物科技有限公司。分别于入院当日、 入院后1周、入院后2周抽取患儿静脉血，采用酶联免 疫法检测MP-IgM，阳性判定标准为s/co值≥1.1定义 为阳性。患儿明确诊断后给予抗支原体治疗，治疗方 法包括休息、呼吸道隔离、积极化痰止咳、保持呼吸 道通畅、必要时进行雾化吸入，抗生素选择阿奇霉素 10 mg/ （kg·d），5 d为1个疗程，6个月以下采用口服阿 奇霉素，抗感染疗程持续10～14 d，部分难治性病例抗 生素延长至3周。 1.3  观察指标  （1）观察两种检查方法不同时间检测阳性率；（2） 观察两种方法及联合检测对不同年龄段患儿的检测阳 性率，联合检测阳性定义为MP-DNA或MP-IgM之一 阳性。 1.4  统计学方法  采用SPSS 23.0进行统计学数据分析。计量资料 采用（x— ±s）表示，行 t 检验；计数资料采用[ n（%）]表 示，行 χ 2 检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。 2  结果 2.1  不同检测方法MP感染检测情况比较 MP-DNA和联合检测入组时MP感染阳性率高 于MP-IgM检测，差异有统计学意义（P＜0.05）；入组 1周、2周时MP-DNA和联合检测MP感染阳性率高于 MP-IgM检测，但差异均无统计学意义（P＞0.05），见 表1。 2.2  不同检测方法在患儿不同年龄阶段最终MP感染 阳性率的比较 MP-DNA、MP-IgM及联合检测的＜4岁、4~7岁、 7~10岁和≥10岁患儿最终MP感染阳性率相比差异均 无统计学意义（P＞0.05）。进一步分析显示，联合检测 高于MP-DNA检测的年龄主要在＜4岁和4~7岁，差 异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

3  讨论 现阶段，随着临床对于肺炎疾病研究程度的加 深，发现疾病产生的一项重要因素为病原体支原体感 染，目前支原体病菌类型已达11种，能够造成人体呼 吸系统损伤的病原体主要为MP病菌。该类病菌细 胞结构独特，其外无细胞壁结构，因此更易通过滤菌 器，含有RNA、DNA两种结构，通过循环代谢产生生 长所需能量。支原体的传播方式较多，唾液、飞沫均 会造成致病菌传播，引起患者呼吸道感染疾病。受致 病菌作用，大部分患者还会出现炎症病灶，使得呼吸 道分泌物进一步增多，造成患者排痰困难或支气管 堵塞。 MP肺炎约占社区获得性肺炎的40％和住院患 者的18％，如未得到及时治疗，可导致一系列并发 症发生，严重影响患儿的身心健康。MP肺炎可发生 于各个季节，多为亚急性发作，主要表现为咳嗽、咽 痛、头痛等临床症状，易发生肺外播散，任何器官均 可累加及，临床报道的肺外表现包括自身免疫性溶 血性贫血、非特异性肌痛或关节痛、心肌炎、心律失 常、心功能不全等，严重者可并发中枢或外周神经系 统病变，甚至可导致死亡。小儿MP肺炎缺乏特异性 临床症状，其临床症状与细菌或病毒感染引起的呼 吸道感染相似，易导致被忽视、误诊和延误治疗。研 究显示[4] ，延误治疗可导致约10.9％的MP肺炎患儿 需要机械通气，3％～4％的患儿出现急性呼吸窘迫 综合征。研究显示，非典型肺炎支原体感染患儿经 验性用药存在明显缺点。近年来，儿童MP肺炎呈现 新的特点，临床上不断有MP感染的报道，使用“重症肺炎支原体肺炎”“难治性肺炎支原体肺炎”“大 环内酯类耐药肺炎支原体肺炎”等名称[5] ，给MP感 染的临床治疗带来新的问题和难点。因此早期、快 速、敏感的诊断MP，对针对性用药、预防MP引发的 并发症及减少MP感染的大规模爆发等具有现实的 意义。 传统的MP检测主要依靠分离培养法和免疫学方 法检测抗原或抗体。经典分离培养法是临床诊断主 要依据，其主要是对咽拭子、气道吸出物、胸腔穿刺液 和肺泡灌洗液进行MP的分离培养。MP大小一般在 0.2～0.3 μM，内含一个环状双链DNA，可在固体培养 基上形成“荷包蛋”样菌洛，但MP基因组的大小仅为 大肠埃希菌的1/6，故其生物合成和代谢能力，需从外 界摄取各种基础养分，人工培养营养要求高。临床标 本中MP含量低，易污染，分离培养时间长，在体外生 长缓慢，判定结果需要3～4周，阳性率低，缺乏早期 诊断的价值。MP-IgM抗体是MP感染后机体最早产 生的抗体，但其形成仍需要一定时间，多于感染1周 左右可检测到，3～4周达到高峰，可持续数月，但婴 幼儿免疫功能相对低下，抗体产生较弱，早期诊断也 比较困难。同时免疫学方法检测时，因MP与其他支 原体存在共同抗原，可导致非特异性交叉反应，降低 了诊断的特异性[6] 。近年来，分子诊断的方法因其特 异性高，敏感性好，在MP的临床检测方面具有较大 优势。 MP M129 株基因组有 816394 bp，含 677 个开放 阅读框，39个RNA编码基因，G+C含量为40％，MP 基因组具有偏嗜性，照常使用的编码是AUU、AAA、UUU、GAA和UUA，最少使用的编码是UGC、CGA、 AGG、UGU。MP PCR检测的靶序列常选在16rRNA 基因组可变区与保守区、特异的染色体片段、P1蛋白 基因区敏感性和稳定性高，但存在基因高效扩增造成 扩增产物污染而导致假阳性的可能[7] 。近年来，以标 记特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR逐步用于 MP-DNA检测，采用完全闭管式操作，减少了扩增产 物污染的机会，提高了检测特异性，并可对扩增产物 进行精确定量分析[8] 。杨文青等[9]对742例患儿进行 荧光定量PCR检测MP-DNA，结果提示荧光定量PCR 法检测患儿MP-DNA水平，具有高敏感性、高特异性、 检测迅速和不存在交叉反应等特点，可作为早期MP 感染的诊断方法。钟伟明等[10] 研究则显示，采用荧光 定量PCR法检测MP-DNA既有利于MP感染的早期 诊断，又可提高诊断的准确性。张志英等[11] 研究显示， 在对213例疑似患儿进行检查，发现痰液MP-DNA检 测准确率要优于血清MP-IgM抗体检测准确率，联合 运用后特异性、敏感性、阴性预测值均较高。本课题 组前期研究显示，MP-DNA对MP的早期检测具有积 极意义[12] 。本研究结果显示，MP-DNA入组时检测阳 性率高于对照组，与既往研究一致。MP-DNA和MPIgM联合检测在入组检出率显著高于单独MP-IgM检 测，在入组时、1周、2周联合检测与MP-DNA单独检 测无显著差异；年龄分层分析显示，联合检测主要在 年龄＜7岁以下儿童中阳性率高于MP-DNA，提示荧 光定量PCR检测MP-DNA检测的阳性率不低于联合 检测，对年龄＜7岁的儿童可考虑联合检测。 综上所述，本研究结果提示荧光定量PCR检测 MP-DNA早期诊断MP感染的价值不低于MP-DNA 和MP-IgM联合检测，可作为年龄≥7岁儿童的主要 检测手段，对年龄＜7岁儿童为减少漏诊，可考虑MPDNA和MP-IgM联合检测。

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